北京大學魏文勝課題組在Nature Biotechnology 發文報道基于堿基編輯的新型高通量功能性篩選方法

2021年6月21日,北京大學生物醫學前沿創新中心、北京未來基因診斷高精尖創新中心魏文勝課題組在Nature Biotechnology在線發表題為“Genome-wide interrogation of gene functions through base editor screens empowered by barcoded sgRNAs”的研究論文。

論文截圖

基于CRISPR-Cas的功能性篩選技術為基因功能研究和藥物靶點發現提供了有力手段。經典的CRISPR敲除篩選方法依賴于Cas9介導的雙鏈DNA斷裂。然而,DNA雙鏈斷裂的產生如果修復不及時會造成嚴重的細胞損傷。因此,Cas9靶向基因組多拷貝位點時極易引起細胞死亡,從而影響基因功能篩選的準確性。此外,在對基因組損傷更為敏感的原代細胞中,基因編輯產生的DNA切割會激活p53信號通路,從而引起細胞周期停滯乃至細胞死亡,使得在細胞中進行大規模篩選比較困難。例如,在有野生型p53表達的人視網膜色素上皮細胞中,經典CRISPR基因敲除篩選呈現出信噪比過低的結果;在人多能干細胞中,對單個基因組位點的編輯也同樣容易造成細胞死亡。近期,多篇報道針對如何在原代細胞中實現大規?;蚪M功能性篩選的技術方案展開爭論和探討,但始終沒有令人滿意的解決方案。

針對上述問題,魏文勝課題組發展了名為iBARed cytosine Base Editing-mediated gene KnockOut (BARBEKO)的新型篩選方案。該方法利用胞嘧啶單堿基編輯器,通過靶向破壞蛋白質編碼基因的起始密碼子位點或剪接位點,或通過引入提前終止密碼子的方式來實現非依賴DNA雙鏈斷裂的高效基因敲除。結合實驗室之前建立的內置分子條形碼(iBAR)設計sgRNA(Zhu et al. Genome Biology 2019),BARBEKO方案可以依賴高病毒感染復數建庫,在提升篩選效率的同時,極大減少了所需細胞數量。相較于經典的CRISPR基因敲除篩選,BARBEKO方法能將篩選所需細胞量降低10-100倍,并能夠通用于正向和負向選擇篩選,可以大幅提升全基因組水平功能性篩選的可行性與經濟性。

BARBEKO方法在多種癌細胞系和表達野生型p53的正常細胞中實現了準確、高效的細胞適應性(fitness)篩選。該方法能有效避免基因拷貝數效應,有效降低負向篩選中與細胞死活相關的高假陽性率;在對DNA雙鏈斷裂敏感的細胞系中,該方法在篩選精度和準確率方面優勢尤為明顯(下圖)。這些結果表明,BARBEKO方法為原代細胞、類器官或模式動物體內等復雜生物模型的高通量篩選提供了更優的選擇,為數量受限的細胞樣品(如病人來源的細胞)提供了高效篩選方案,因此是基因功能和臨床前研究的有力工具。

BARBEKO篩選策略有效提升基因敲除篩選效率和準確性.jpg

BARBEKO篩選策略有效提升基因敲除篩選效率和準確性

北京大學魏文勝課題組博士生許萍、劉志恒博士、劉瑩博士和博士生馬華崢為該論文共同第一作者。該研究項目得到國家自然科學基金重點項目、北京市科委生命科學前沿創新培育項目、北京未來基因診斷高精尖創新中心和北大-清華生命科學聯合中心的支持。

轉載本網文章請注明出處

国产精品福利2020久久